维甲酸对广义颅面短小畸形致病基因影响的生物信息学分析

2

eHFM作为术语在国际学界普遍认可，尤其适用于统一研究 eHFM内各个亚组间共性的基因组学、形态学、胚胎学、解剖学等相关发病机制。笔者首次将其翻译介绍并应用于中文研究。随着孟德尔遗传数据库的推荐命名更改，并且 eHFM 可双侧发病，其医学术语本身有局限于单侧发病的指向，我们建议使用 eCFM 更利于机制的探究。eCFM有显著 的遗传易感性，但对于遗传模式未有共识。与有迹可循的遗传家系相比，散发病例占绝大部分比例。散发病例的风险因素主要是母体已知风险和孕期接触致畸剂相关。其中维甲酸广泛存在于生活用品中，现在已经被证实与小耳畸形和颅面短小高度相关。维甲酸是维生素 A 的衍生物，正常剂量的维甲 酸对于神经嵴组织的形成和发育有正向调节作用。而过量维甲酸的胚胎毒性会引起外耳发育的组织神经嵴和第一二腮弓发育异常。刘磊[7]报道， 过维甲酸可干扰多种途径和通路、多种发育相关的基因表达调控而抑制外耳软骨细胞的增殖。2017 年 Kriangkrai 等[8]报道，维甲酸对叶酸代谢的 干扰可能是其致畸的原因，补充叶酸可以改善维甲酸所致的畸形。

eCFM突变基因较难筛查，传统实验方法筛查基因在精力和时间中花费巨大。对于大样本数据很难逐一排查得到系统性分析和预测。分析模式也较为局限，不同的蛋白之间相互作用验证有限。而生物信息学可以通过荟萃文献、分子构象、基因靶点等多种方法，将物理和功能多方位信息加以整合[9]。适应于预测疾病的未知致病基因及作用的通路机制。

比较毒理基因组学数据库收集了化学物与基因间靶点作用信息。ToppGene 数据库使用统计学算法，根据候选基因和已知基因之间的功能相似性对候选基因排序（V Kaimal, 2010 年）。STRING 数据库内通过文献证据、实验证据、蛋白质结构、基因关系等途径可视化基因所编码蛋白的直接、间接作用关系[10]。结合 Cytoscape 的 CytoHubba 插件的评分排序可预测潜在致病基因[11]。

蛋白互作（protein-protein interaction, PPI）网络中将单点信息通过基因本体、信号通路、蛋白质结构域等注释信息构建为成全局互作网络。在已知致病信息基础上通过网络节点追溯潜在致病分子。使用 CytoHubba 插件筛选关键节点基因[12]，依据最大中心性集团算法筛选出前 17 项关键节点基因：TP53、JUN、CTNNB1、MAPK1、CREB1、HIF1A、PPARG、 RELA、SMAD3、NFKB1、SMAD4、GATA4、POU5F1、 GATA3、PAX6、NKX2-5、PTPN11。关键节点中包含已被证实的致病基因，如 MAPK1 在咽弓发育和先天性心脏病中起着重要作用[13]；GATA3 在内皮细胞生物学中发挥重要作用，如果缺陷可引起感觉神经 性耳聋[14-15]。MTHFR 是叶酸代谢的重要开关。通过 Pathcard 数据库比对，CREB1 影响了叶酸 - 乙醇和癌症通路。PPARG 参与的葡萄糖 / 能量代谢通路和代谢通路，TP53 通过调控氟嘧啶活性，并和 RELA、 NFKB1 共同作用的微量元素硒的网络通路，都明确影响叶酸代谢。叶酸在颅神经嵴发育中十分关键， 其能在路神经嵴的快速分化中提供大量甲基，改善颅神经嵴的表观遗传学调控，以及清除对颅神经嵴 细胞周围的氧化物和自由基，防止因过度氧化而导致的颅神经嵴细胞异常凋亡[16]。我们通过生物信息学方法间接预测了维甲酸导致的广义颅面短小畸 形可能与叶酸缺乏影响的颅神经嵴发育异常有关。

除 此 之 外 ， 我 们 还 需 要 注 意 CTNNB1 与 Wnt/β-Catenin 通路密切相关，CTNNB1 基因突变可导致 Wnt 途径被异常激活，Wnt 配体竞争性地与膜上受体结合，明显影响细胞的迁移、增殖[17]。NKX2-5 可通过自身的多个功能性结构域发挥作用。NKX2-5 经转录翻译后进入细胞核内，通过与 CO-factors 结合或单独结合于特定 DNA 序列，对下 游调控分子起激活或抑制作用，从而影响心肌前体细胞的增殖、迁移、分化，如果缺乏可引起先天性心脏病等心脏发育异常[18]。PTPN11 是 RAS/MAPK 信号转导通路的上游，其基因突变与耳聋、心脏畸形明显相关[19-20]。

从 GO 分析可见维甲酸影响 eCFM的三个方面：⑴生物过程。维甲酸主要在胚胎期间影响胚胎的形态和发育，涉及结构、形态和器官的发育发生。⑵分子功能。维甲酸致畸在分子层面主要是调控了 DNA 间结合、DNA 与转录、调控因子间结合活性。⑶细胞组成。在作用位点上主要是以细胞核及细胞内细胞器为主。尽管先天畸形的生物信息学注释通路数量远低于肿瘤学。在通路中我们发现，干细胞多能性调控通路和破骨细胞分化具有明显的统计学意义，这些通路中可以看到 MAPK1 和 CTNNB1作为关键节点出现。

综上所述，维甲酸主要是作用于胚胎发育的关键时期，通过影响颅神经嵴细胞的叶酸代谢及多种途径广泛干预胚胎细胞从结构到功能进一步分化发育。国际首次基于生物信息学方法探究维甲酸影响广义颅面短小畸形的潜在致病基因。

未来研究我们还需大样本的基因测序比对，以及用分子生物学的细胞实验验证致病基因，在动物实验中敲除或沉默致病基因了进一步证实预测。进 一步探究维甲酸对 eCFM致病的作用机制，有助于产前指导和个体化诊断与筛查。