离心制备富血小板血浆对其参数及活性影响的研究进展

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5.1 离心对血小板形态的影响 离心能够对血小板形态甚至内部结构产生较大影响。Bausset 等[27]采用不同的离心力（130~1000×g）对 54 例健康志愿者的全血进行离心制备 出 PRP 后，通过透射电子显微镜对血小板进行了超微结构分 析。结果表明，较高的离心力可以显著改善 PRP 制备过程中 血小板的形态，在 130×g 离心力下，血小板呈盘状，伪足数 量较少，细胞质内是大量颗粒、致密体、线粒体和糖原颗粒随机分布，这些特征与静息时血小板已知形态一致。而在 250×g和 400×g 离心力下制备的 PRP，其血小板形态明显发生变化，如呈球形，大量伪足扩张，颗粒集中，与血小板激活时的形态相似。说明离心力越大，其形态结构改变越明显，并可能会提前激活血小板。

5.2 离心对生长因子、细胞因子释放的影响 浓缩血小板制备方法种类较多，不同的制备方法，得出的浓缩血小板中其活性成分含量与生物学效用也不尽相同，如生长因子、细胞因子浓度以及内部立体的分子构象的差别巨大。Yin 等[13]研 究表明，初次离心力 <160×g、二次离心力 <250×g，随着离心力逐渐增大，PDGF-AB、TGF-β1 因子释放逐渐增多。当初次离心力、二次离心力分别等于 160×g、250×g 时为释放最高值。初次离心力、二次离心力分别大于 160×g、250×g， PDGF-AB、TGF-β1 因子释放逐渐减少。Arora[2]研究表明，制备 PRP 时不同的离心参数能够改变生长因子的释放数量，并进一步影响临床结果。离心参数为 208×g 离心 20 min 时， PDGF-AB、TGF-β1、VEGF 数值分别为 58.8、92.9、5.84 pg。离心参数为 440×g,10 min 时，PDGF-AB、TGF-β1、VEGF 数值分别为 82.3、100、9 pg。Landesberg 等[22]离心力＜200×g 时，血小板破坏较少。离心力 250×g 以上时，制备的血小板中出现膜破裂的占比较大。>800×g 的离心力可能会因血小板破坏过多，最后在 PRP 应用中减少了释放的生长因子、细胞因子的数量。毕衡等[28]研究表明，比较一次（Aghaloo 法）与二次 （Landesberg 法、Aghaloo 法）离心法，从大耳白兔的全血中提取出富血小板血浆，检测 PDGF 和 TGF-β1 值。激活前 PDGF 和 TGF-β1 值差别不显著。激活 PRP 后再检测 PDGF 和 TGF-β1 值，差别具有统计学意义。

关于离心对生长因子、细胞因子的影响，以及最大的离心参数还需要进一步深入探讨。

5.3 离心对血小板聚集率的影响现在很多的研究都证实， 离心力过大或离心时间过长，会诱发血小板激活、聚集，形成 白色斑块，因而影响血小板的浓度与功能[29]。Bausset 等[27]在 同一实验中同时做了有关血小板聚集率试验，不同的离心力制备出 PRP 后，立即检测血小板的聚集率。结果发现，与较低的离心力相比，较高的离心力（1000×g）在制备 PRP 过程中，36%的病例诱导了血小板的自发自聚集。表明高旋转离心可能影响血小板功能，不适合制备 PRP。Miyazaki 等[30]研究发现，高水平的剪切应力可以在不添加任何激动剂的情况下产生血小板聚集，改变血小板活性。随着剪切应力持续时间的增加，血小板质膜微粒的脱落逐渐增多。

5.4 离心对富血小板血浆来源的胞外囊泡的影响 离心主要是通过两方面产生剪切应力，一个是离心时来自管壁的摩擦产生剪切力，另一个是重悬时液体与空气混合震荡中产生的剪切力。Antwi-Baffour 等[31]认为，离心产生剪切应力，能刺激血小板活化或凋亡，并释放胞外囊泡。当血小板被激活时， 混杂酶、钙蛋白酶和凝溶胶蛋白从内皮网释放钙而被激活， 裂解长肌动蛋白丝和肌动蛋白，易位酶失活，膜不对称性受损。然后，细胞骨架上的蛋白质锚定被破坏，允许膜出芽，从而导致胞外囊泡的形成和释放。štukel 等[32]认为，离心产生的剪切应力可引起血小板活化，并释放细胞外囊泡到血液中， 释放的囊泡浓度与剪切力的作用呈正相关。所以可以通过高速离心采集到细胞外囊泡。

5.5 离心与血小板活化标志物 CD62P 表达率的关系 CD62P 是血小板中的活化标志物，称为 GMP-140，或称为血浆 P- 选择素。血小板被激活后，血小板中的α颗粒膜经过开放性管道并与之融合，生成的 CD62P 汇聚在血小板膜的表层。离心对 CD62P 的影响主要是与离心力有关。袁霆和张长青[33]按上述四种制备方法制备 PRP，采用对比分析法对不同 PRP 制备 方法得出的全血血小板活化率进行了系统研究。研究发现， 4 种离心方法制备的 PRP，其 CD62P 表达率均比未离心的全血高，离心力越大，离心次数越多，CD62P 表达率越高，血小板活化越明显。卢萌等[34]分别对 4 种离心条件下制备的富血小板血浆，其血小板浓度与活性水平进行了分析，发现不同离心条件下制备出的 PRP 血小板活性物质 P- 选择素浓度存在较大差异，在一次离心参数为 200×g、10 min 和二次离心参数为 1200×g、10 min 的条件下，PRP 血浆 P- 选择素浓度为最低水平，血小板活性受到的负面影响非常有限。Perez 等[35] 比较离心前血浆和不同离心力制备 PRP 后检测的 P- 选择素浓度，在离心制备之前的血浆中，P- 选择素在初始状态下 的浓度值为 18~40 ng/ml，二次离心时，随着离心力的增加， P- 选择素逐渐升高，当离心力为 800×g 和 1200×g 时， P- 选择素达 50 ng/ml 以上，血小板出现明显活化。但当离心力增大到一定程度或者多次高速离心时，P- 选择素浓度并不随着离心力增大而继续无限增高。Anna[26]研究发现，当第一次离心 2000×g，10 mim 后，再次予同样离心力离心 10 mim， 发现 P- 选择素浓度并无进一步增高。这表明所有能被离心激活的血小板都在第一次离心时已被激活。