TTYH2在皮肤黑色素瘤中的表达及其预后价值

TTYH2在皮肤黑色素瘤中的表达及其预后价值

杨文超杨彦娥贾垚张宝林

本文来源：《中华整形外科杂志》2023年7月第39卷第7期

DOI:10. 3760 / cma.j.cn114453-20220410-00104

作者单位：山西医科大学公共卫生学院，太原030001

通信作者：张宝林，Email: zbl88@126.com

引用本文

杨文超,杨彦娥,贾垚,等. TTYH2在皮肤黑色素瘤中的表达及其预后价值[J]. 中华整形外科杂志,2023,39(07)：770-777. DOI:10.3760/cma.j.cn114453-20220410-00104

【摘要】

目的探讨蛋白tweety同源物2(TTYH2)在皮肤黑色素瘤(SKCM)中的表达水平、作用机制和对临床预后的意义。

方法从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载365例皮肤黑色素瘤患者的表达数据和临床信息，以基因型和基因表达量关联数据库(GTEx)下载812例健康人皮肤组织表达数据，分析TTYH2在SKCM组织和正常组织中的表达水平。生存分析和Cox比例风险回归分析用于评估TTYH2表达对SKCM患者预后生存的影响。京都基因组百科全书(KEGG)通路富集分析和基因本体(GO)分析用于筛选TTYH2显著富集的信号通路。应用STRING在线平台进行蛋白质互作网络分析，筛选关键的蛋白质网络节点基因。免疫细胞浸润分析使用CIBERSORT算法分析22种免疫细胞在每个样本中的表达情况，使用卡方检验分析高、低表达组中免疫细胞的差异，P<0.05为差异有统计学意义。

结果 SKCM患者TTYH2的表达明显高于正常组织中的表达。生存分析表明SKCM患者TTYH2高表达组具有较差的预后。TTYH2高表达是SKCM总生存率差的独立预测因子(HR＝1.21，95%CI 1.08~1.37，P＝0.001)。KEGG结果显示TTYH2主要富集在细胞突触、离子通道、钙信号通路和细胞外基质-受体相互作用途径等相关通路上，GO分析得出TTYH2参与的生物过程等均可能与肿瘤的发生发展密切相关；蛋白互作网络分析显示，TTYH2与氯化物胞内通道蛋白5、氯离子通道蛋白2、甘氨酸受体家族成员和γ-氨基丁酸受体家族成员等有相互作用，揭示了其可能在SKCM的发病过程中具有重要作用。免疫细胞浸润分析显示，记忆B细胞、CD4记忆T细胞和单核细胞在TTYH2低表达组中的丰度显著增加，而在TTYH2低表达组中滤泡辅助T细胞和调节性T细胞的丰度显著降低。

结论 TTYH2的表达可能通过多种途径调控SKCM细胞的发生发展，影响SKCM患者的生存预后，是SKCM潜在的生物学预后标志物及治疗靶标。

【关键词】预后；皮肤黑色素瘤；蛋白tweety同源物2；Cox回归分析；癌症基因组图谱

基金项目：山西省卫生健康委科研课题资助项目（2020089）

The expression and prognostic value of TTYH2 in skin cutaneous melanoma

Yang Wenchao, Yang Yane, Jia Yao, Zhang Baolin

School of Public Health, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China

Corresponding author: Zhang Baolin, Email: zbl88@ 126. com

【Abstract】

Objective To investigate the expression level, development mechanism, role and clinical prognostic significance of tweety homolog 2 (TTYH2) in cutaneous melanoma (SKCM).

Methods The expression data and clinical information of 365 cutaneous melanoma patients were downloaded from the Cancer Genome Atlas (TCGA), and the expression data of 812 normal tissues were retrieved from the genotype and Genotype-Tissue Expression(GTEx) to analyze the expression level of TTYH2 in SKCM tissues and normal counterparts. Survival analysis and Cox proportional hazard regression analysis were used to evaluate the effect of TTYH2 expression on prognosis and survival in SKCM patients. Gene set enrichment analysis Kyoto Genome Encyclopedia (KEGG) and Gene Ontology (GO) were used to screen signaling pathways for significant TTYH2 enrichment. The interaction network analysis was carried out using STRING online platform to screen key protein network node genes. Secondly, CIBERSORT algorithm was used to analyze the expression of 22 immune cells in each sample, and Chi-square test was applied to analyze the difference of immune cells in the high-low expression group.

Results The expression of TTYH2 in SKCM patients was significantly higher than that in normal tissues. Survival analysis showed that SKCM patients with high TTYH2 expression group had a poor prognosis. High TTYH2 expression was an independent predictor of poor overall survival of SKCM (HR=1.21, 95%CI 1.08-1.37, P=0.001). KEGG result showed that TTYH2 was mainly concentrated in cell synapses, ion channels, calcium signaling pathways and extracellular matrix receptor interaction pathways. GO analysis showed that the biological processes involved in TTYH2 may be closely related to the occurrence and development of tumors. TTYH2 interacts with chloride intracellular channel protein 5, chloride ion channel protein 2, glycine receptor family members and gamma-aminobutyric acid receptor family members, suggesting that TTYH2 may play an important role in the pathogenesis of SKCM. Immune cell infiltration analysis showed that the immune cell abundance of memory B cells, CD4 memory T cells and monocytes was significantly increased in the TTYH2 low expression group, while the immune abundance of follicular helper T cells and regulatory T cells was significantly decreased in the TTYH2 low expression group.

Conclusion TTYH2 expression may regulate the development of SKCM cells through various ways, affect the survival and prognosis of SKCM patients, and is a potential biological prognostic marker and therapeutic target of SKCM.

【Key words】Prognosis; Cutaneous melanoma; Protein tweety homolog 2; Cox regression analysis; Cancer genome atlas

Fund program: Shanxi Provincial Health Commission (2020089)

Disclosure of Conflicts of Interest: The authors have no financial interest to declare in relation to the content of this article.

皮肤黑色素瘤(skin cutaneous melanoma，SKCM)是一种常见的皮肤恶性肿瘤，其发病率占所有皮肤癌的4%~11%，但死亡率接近皮肤肿瘤总死亡率的3/4[ 1 ]。目前，手术是SKCM主要的标准治疗方法。在没有特异性临床表现的早期(Ⅰ、Ⅱ)SKCM患者中，手术治疗后的5年生存率高达90%，但在晚期SKCM患者中并没有标准治疗方法[ 2 ]。尽管对SKCM生物学、遗传学的免疫疗法、早期诊断和预防的理解方面取得了很大进展，但由于其发病率不断上升且缺乏有效的先进治疗，促使其成为全球医疗保健的负担[ 3 , 4 ]。研究表明，蛋白tweety同源物2(tweety homolog two，TTYH2)的表达水平对恶性肿瘤的发生发展具有潜在作用，TTYH2在各种癌细胞中都充当体积调节阴离子通道(volume regulated anion channel ，VRAC)参与细胞体积调节、增殖、迁移和细胞死亡等功能[ 5 ]。但目前对TTYH2在肿瘤中的机制研究相对很少。因此，本研究初步探讨TTYH2作为一种新的SKCM患者早期筛查及预后判断的肿瘤标志物可行性，旨在为后续开展实验性研究及黑色素瘤早期诊断和预后判断提供理论指导。

资料和方法

一、资料获取

从癌症基因组图谱( The Cancer Genome Atlas, TCGA )数据库( https: //cancergenome.nih.gov)中下载所有SKCM患者的mRNA表达谱数据及相应的临床数据信息。从基因型和基因表达量关联数据库(Genotype-Tissue Expression，GTEx)中下载正常皮肤组织样本mRNA表达谱数据作为对照。纳入标准：TCGA数据库皮肤相关肿瘤中初步诊断为黑色素瘤的患者；"informed consent verified"为"YES"；具有完善的表达谱数据和临床相关资料；GTEx数据库中"primary site"定位为"skin"。排除标准：为了减少统计偏差，排除生存信息值缺失及生存期小于30 d的病例，以规避手术相关并发症造成的死亡病例。

二、研究方法

分析TCGA数据库样本的数据，TNM (Tumor Node Metastasis) 分期根据美国癌症分期联合委员会(American Joint Committee on Cancer，ACJJ)第七版分期。

(一)TTYH2在正常组织和SKCM中的表达

用R软件sva包去批次后合并SKCM和正常组织并提取TTYH2的mRNA表达数据。R软件Limma包用于探索TTYH2的表达在SKCM和正常组织之间是否存在显著差异。

(二)生存分析

将TTYH2表达数据与生存信息相匹配，根据TTYH2的表达水平的中位值将患者分为2组：TTYH2低表达组和TTYH2高表达组。使用R软件survival包进行生存分析和可视化，得到Kaplan-Meier生存曲线。

(三)单变量和多变量Cox回归分析

Cox比例风险回归模型用于进行单变量和多变量分析。计算风险比(HR)值和95%置信区间(CI)。在单变量分析中，评估临床病理参数和TTYH2表达对生存的独立预测价值。多变量Cox回归分析比较TTYH2表达对生存的影响，TTYH2表达的截止值是根据中位表达值设置的。数据通过使用R软件survival包进行分析，并通过R软件的forestplot包进行可视化。

(四)富集分析

基因本体功能(gene ontology，GO)富集分析从分子功能、生物过程以及细胞组分3个方面对基因进行标准化注释；京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析了解差异基因显著富集的代谢通路。探索SKCM中与TTYH2相关的信号通路。数据通过org.Hs.eg.db包和clusterProfiler包分析，并通过barplot包进行可视化。

(五)蛋白互作网络(protein-protein interaction network，PPI)和基因功能分析

基于STRING数据库(https：//cn.string-db.org)分析TTYH2的蛋白互作网络。下载与TTYH2相关的共表达蛋白及PPI网络图。最低要求的互动分数为中等置信度(0.400)。

(六)免疫细胞浸润分析

使用R软件CIBERSORT算法分析TCGA数据集中SKCM患者的免疫细胞浸润程度。CIBERSORT算法利用基因表达数据估算基因表达谱并提供混合细胞群体中各成员细胞类型的丰度估计。使用蒙特卡洛采样，CIBERSORT为每个样本计算去卷积的P值，以提供估计的置信度。选取P<0.05的样本进行后续分析。通过R软件CIBERSORT包分析22种免疫细胞在每个样本中的表达情况，再进行TTYH2高、低表达组免疫细胞浸润的差异分析。比较TTYH2高、低表达组免疫细胞的浸润情况差异。

三、统计学分析

采用SPSS统计软件(26.0版)和R软件(4.1.1版)进行统计分析。差异基因的截断值为差异表达倍数的对数值(∣LogFC∣)>1和调整后的P<0.05。采用独立样本t检验比较2组TTYH2表达的差异。采用卡方检验和逻辑回归分析评估TTYH2表达与临床特征之间的关系。Kaplan-Meier分析用于探索存活率与TTYH2表达水平之间的关系。Cox比例风险回归模型用于单变量和多变量生存分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般资料

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