microRNA-27b、microRNA-221、microRNA-222和血管内皮生长因子在瘢痕疙瘩中的表达及相关性研究

microRNA-27b、microRNA-221、microRNA-222和血管内皮生长因子在瘢痕疙瘩中的表达及相关性研究

朱学娥向芳罗东康晓静丁媛

本文来源：《中华整形外科杂志》2023年8月第39卷第8期

DOI:10. 3760 / cma.j.cn114453-20220808-00246

作者单位：新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科新疆皮肤病临床医学研究中心新疆皮肤病研究重点实验室（XJYS1707），乌鲁木齐830001

通信作者：丁媛，Email：dydyuan@126.com

引用本文

朱学娥,向芳,罗东,等. microRNA-27b、microRNA-221、microRNA-222和血管内皮生长因子在瘢痕疙瘩中的表达及相关性研究[J]. 中华整形外科杂志,2023,39(08)：844-850. DOI:10.3760/cma.j.cn114453-20220808-00246

【摘要】

目的探讨瘢痕疙瘩中microRNA-27b(miR-27b)、miR-221和miR-222的表达及与血管内皮生长因子(VEGF)的关系。

方法选取2021年1月至2022年1月新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科手术切除的瘢痕疙瘩组织(瘢痕疙瘩组)及对应瘢痕旁正常组织(正常对照组)各36例，另选择同期符合诊断标准的扁平瘢痕(扁平瘢痕组)12例。采用免疫组织化学法测定3组中VEGF蛋白表达情况和微血管密度，通过实时荧光定量PCR检测miR-27b、miR-221和miR-222表达水平。采用SPSS 27.0统计软件进行分析，正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两多重比较采用LSD法；非正态分布的计量资料以M(Q1，Q3)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验；数据间的相关性分析采用Spearman相关分析法，所有检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果瘢痕疙瘩组VEGF蛋白表达水平和微血管计数[0.28±0.08、(47.78±14.06)条/400倍视野]明显高于正常对照组[0.09±0.05、(10.25±5.08)条/400倍视野]和扁平瘢痕组[0.19±0.06、(23.75±7.94)条/400倍视野]，差异有统计学意义(P<0.01)。瘢痕疙瘩组miR-27b表达水平[0.50(0.32，0.64)]显著低于正常对照组[0.69(0.37，1.69)]和扁平瘢痕组[1.35(1.25，1.74)]，差异有统计学意义(P<0.01)；而3组miR-221及miR-222的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示，瘢痕疙瘩组中miR-27b、miR-221、miR-222与VEGF蛋白表达均呈正相关关系(r＝0.36、0.41、0.37，P均<0.05)。

结论 miR-27b在瘢痕疙瘩、扁平瘢痕及正常组织中表达具有差异性，瘢痕疙瘩中miR-27b、miR-221和miR-222与VEGF表达呈正相关，提示miRNA/VEGF轴可能在瘢痕疙瘩发生和进展中起到关键性作用。

【关键词】瘢痕疙瘩；微RNAs；血管内皮生长因子；相关性分析

基金项目： 新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（2019D01C134，2021D01C147）

Expression and correlation of microRNA-27b, microRNA-221, microRNA-222 and vascular endothelial growth factor in keloids

Zhu Xue’e, Xiang Fang, Luo Dong, Kang Xiaojing, Ding Yuan

Department of Dermatology and Venereology, People’ s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Xinjiang Clinical Research Center for Dermatologic Diseases, Xinjiang Key Laboratory of Dermatology Research (XJYS1707), Urumqi 830001, China

Corresponding author: Ding Yuan, Email: dydyuan@126.com

【Abstract】

Objective To investigate the expression of microRNA-27b (miR-27b), miR-221 and miR-222 in keloids and their relationships with vascular endothelial growth factor (VEGF).

Methods From January 2021 to January 2022, 36 cases of keloid tissue (keloid group), 36 cases of adjacent normal tissue (normal control group) and 12 cases of flat scars (flat scar group) were collected from Dermatology and Venereology Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital. VEGF protein expression and microvessel density in the three groups were determined by immunohistochemistry, and the expression levels of miR-27b, miR-221 and miR-222 were detected by real-time quantitative PCR. SPSS 27.0 statistical software was used for statistical analysis. The normally distributed measurement data were expressed as Mean±SD. ANOVA was used for multi-group comparison, and the LSD method was used for pound-for-pair multiple comparisons. The measurement data of non-normal distribution were expressed as M (Q1, Q3), and Kruskal-Wallis H test was used for the comparison between groups. Spearman correlation analysis was used for the correlation analysis among data. All tests were bilateral tests, and P<0.05 was considered statistically significant.

Results The levels of VEGF protein and microvessel count in the keloid group [0.28±0.08, (47.78±14.06) bar /×400 view] were significantly higher than those in normal control group [0.09±0.05, (10.25±5.08) bar /×400 view] and flat scar group [0.19±0.06, (23.75±7.94) bar /×400 view], the difference was statistically significant (P<0.01). The expression level of miR-27b in keloid group [0.50 (0.32, 0.64)] was significantly lower than that in normal control group [0.69 (0.37, 1.69)] and flat scar group [1.35 (1.25, 1.74)], the difference was statistically significant (P<0.01). There were no significant differences in the expression levels of miR-221 and miR-222 among the three groups (P>0.05). Correlation analysis showed that miR-27b, miR-221, miR-222 were positively correlated with VEGF protein expression in keloid group (r=0.36, 0.41, 0.37, P<0.05).

Conclusion The expression of miR-27b is different in keloid, flat scar and normal tissue. miR-27b, miR-221 and miR-222 are positively correlated with VEGF expression in keloid, suggesting that the miRNA/VEGF axis may play a key role in the occurrence and progression of keloid.

【Key words】Keloid; microRNAs; Vascular endothelial growth factor; Correlation analysis

Fund program: Natural Science Fund Program of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2019D01C134,2021D01C147)

Disclosure of Conflicts of Interest: The authors have no financial interest to declare in relation to the content of this article.

Ethical Approval: Ethical approval was given by the Medical Ethics Committee of People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region (KY2019051549).

瘢痕疙瘩是整形外科、烧创伤外科和皮肤科的常见病和多发病，可能对患者造成严重的容貌焦虑、瘙痒、疼痛，甚至引起关节活动受限，严重影响患者的身心健康和社会生活。虽然瘢痕疙瘩的治疗方法多种多样，如局部手术切除联合放疗、激光治疗和化学疗法，但大都存在治疗周期长、不良反应大、复发率高等问题[ 1 ]。近年来发现，微RNA(microRNA，miRNA)是不同细胞途径中基因表达的重要调节剂，几乎涉及到伤口愈合过程的各阶段，与瘢痕疙瘩的侵袭发展密切相关[ 2 ]，但对于瘢痕疙瘩血管生成相关miRNA的研究国内外鲜有报道。Sun等[ 3 ]的细胞实验证实，调节miRNA-27b(miR-27b)可促进血管生成和成纤维细胞活化，其机制与激活PI3K/AKT信号通路有关。已知miR-221与miR-222在核酸序列上非常接近，具有相同的"种子序列"，在调控机制上常出现同步变化[ 4 ]。在人类恶性肿瘤中，miR-221和miR-222因其致癌作用和作为有前景的生物标志物而被广泛研究[ 5 ]。已有研究将miR-221的反义寡核苷酸用于人体临床试验，评估其对于肿瘤的治疗作用[ 6 ]。研究证实血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在瘢痕疙瘩中高表达，通过刺激内皮细胞或影响炎症细胞间接调节瘢痕疙瘩形成，在瘢痕疙瘩发生发展中具有重要作用[ 7 ]，但目前关于瘢痕疙瘩中miRNA与VEGF之间的相关性尚无报道。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测瘢痕疙瘩组织中miR-27b、miR-221、miR-222的表达量，并探讨其与VEGF的相关性，为瘢痕疙瘩的治疗提供新的方向。

资料与方法

一、标本来源

选择2021年1月至2022年1月新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科门诊及住院部收集的瘢痕疙瘩组织作为瘢痕疙瘩组，并取瘢痕疙瘩旁正常组织(距离瘢痕疙瘩3~5 mm)作为正常对照组。另外选择同期符合诊断标准的扁平瘢痕组织作为扁平瘢痕组。瘢痕疙瘩诊断标准[ 8 ]：(1)肿块隆起于皮肤表面，坚硬，表面光滑发亮，界限欠规则，1年内无退缩征象；(2)病变超过原始损伤边缘，向周围正常组织发生浸润，呈蟹足状生长；(3)具有持续性生长、发红、疼痒等临床症状，无自愈倾向，不能自行消退；(4)病理学检查显示组织内有胶原及基质成分的大量沉积，成纤维细胞很多，并有分裂相。扁平瘢痕诊断标准[ 9 ]：(1)皮损与周围皮肤基本平齐，表面平、有光泽，局部皮肤颜色变浅或深；(2)病变局限性生长，不累及周围皮肤；(3)影响美观，但没有不适的感觉和功能障碍；(4)病理学检查显示一般只累及表皮或真皮浅层，表皮为菲薄的上皮结构，仅有几层上皮细胞组成，胶原纤维早期排列紊乱，后期可规律排列。纳入标准：(1)瘢痕疙瘩及扁平瘢痕均经临床和病理确诊，病理切片经3位高年资病理医师进行阅片明确诊断；(2)无垂体和肾上腺疾病、传染病、感染性溃疡等；(3)患者知情并同意参与本研究。排除标准：(1)术前应用免疫制剂、糖皮质激素或放射治疗的患者；(2)皮肤病患者；(3)增生性瘢痕患者。

本研究取得新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准同意(KY2019051549)。纳入研究前均告知患者并签署知情同意书。

二、方法

(一)免疫组化染色

1．步骤

VEGF抗体试剂(货号：ZM-0265)、CD34抗体试剂(货号：ZM-0046)、DAB显色试剂盒均购自中杉金桥公司。全部标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚度3 μm。72 ℃烤片1 h，将组织切片逐步进行二甲苯脱蜡(2~3缸，10 min/缸)和梯度乙醇水化(100%、85%和75%乙醇各5 min)，然后置于EDTA抗原修复缓冲液(货号：ZLI-9066，中杉金桥公司)中进行抗原修复，冷却至室温。加入3%双氧水阻断内源性过氧化物酶，室温封闭30 min。滴加CD34抗体试剂(直接使用)、VEGF抗体试剂(直接使用)，4 ℃孵育过夜。洗涤后滴加二抗(酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，货号：PV-6000，中杉金桥公司，直接使用)，室温下孵育50 min。加入DAB显色液染色5 min，冲洗，苏木素复染3 min，脱水，中性树胶封片。室温下干燥48 h，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)代替一抗作为阴性对照。实验开始前对课题组成员进行标准化免疫组化实验的操作培训，3组标本编号后盲法同时进行操作，以控制烤片、脱蜡、修复等步骤的人为操作差异。

2．结果判定

血管密度判定：镜下可见黄褐色小血管腔，多为类圆形，部分无明显血管腔，呈条索状，切片背景清晰，易于做血管计数。先在低倍镜(×100)下观察皮肤组织比较连续的部位，然后在400倍光镜下从表皮到基底选择计数5个视野的微血管数目，以其均数代表该组织内的微血管计数(microvessel count，MVC)，单位为微血管条数/400倍视野。

VEGF蛋白表达判定：VEGF染色为棕黄色或黄褐色颗粒分布于胞浆中。先在低倍镜(×100)下选择皮肤组织比较连续的部位，然后在200倍光镜下从表皮到基底采集5个视野图像。利用Image pro plus 6.0软件进行分析，取5个视野的均数即平均光密度值表示VEGF表达强度。

(二)qRT-PCR检测

取手术切除组织，立即采用生理盐水冲洗，去除结缔组织并置于－80 ℃液氮保存。取冻存组织50 mg液氮下研磨成粉，采用Trizol法提取组织总RNA。按One-Step gDNA Removal and cDNA试剂盒说明(货号：AT311-03，全式金生物公司)将提取的总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min, 70 ℃ 5 min。以cDNA为模板，进行PCR扩增，引物由武汉赛维尔生物科技有限公司设计合成，引物序列设计见表1 。以U6作为内参，使用PCR试剂盒对miRNA进行定量检测。反应条件：预变性，95 ℃ 10 min；循环反应，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共40个循环。每个样本的每个基因保证3个复孔，重复3次，取平均值。依据所得Ct值，采用2－ΔΔCt相对定量法分别计算被检组织中miRNA的表达量。

microRNA-27b、microRNA-221、microRNA-222和血管内皮生长因子在瘢痕疙瘩中的表达及相关性研究

三、统计学方法

采用SPSS 27.0统计软件进行分析，正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两多重比较采用LSD法；非正态分布的计量资料以M(Q1，Q3)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验；性别构成比较采用χ2检验。计量资料间的相关性分析采用Spearman相关分析法。所有检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般情况

......